【行标】污水处理中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准-WS/T 799—2022

>7.1.2.2.1.冷藏背著盖离心管：1.5mL，无大分子酶；50mL或250mL，可背负重合力≥12000g。

7.1.2.2.2.冷藏移试管器吸头：1mL，背著滤芯，无大分子酶。

7.1.2.2.3.冷藏移试管管：50mL。

7.1.3.器材电源

7.1.3.1.高速冷藏甲醇：4℃，50mL或250mL飞轮，可背负重合力≥12000g。

7.1.3.2.电子天平：分辨合力不低于0.001g。

7.1.3.3.微生物安全和柜：II级或II级以上。

7.1.3.4.高热灭菌器。

7.1.3.5.移试管器：1mL。

7.1.3.6.高效率电动移试管器。

7.1.4.可溶性一定量量化流程

7.1.4.1.先于离心

用高效率电动移试管器分别移所取3份35mL污染物检验摆在3个50mL离心管之前，在4℃、2500g有条件下离心30min，将上清试管分别移到到另外3个50mL离心管之前机内。剩下污染物检验作为硬盘。

中有1：当污染物检验悬浮物浓度过高，可能直接影响大肠杆菌大分子所含和可视发射光谱RT-PCR检验时，应该改用先于离心弃除悬浮物后先顺利没完成在此之后加载。

中有2：若搭配250mL离心管，可同样所取105mL污染物检验于250mL离心管之前，在上述有条件下离心后将上清试管移到到另外1个250mL离心管之前机内。

7.1.4.2.第二次离心

在3个备有35mL污染物检验或先于离心后上清试管的50mL离心管之前分别转到3.5g±0.1g染剂和0.79g±0.01g钾，合理混杂，此后醛完全蒸发，该蒸发每一次约需15min。然后在4℃、12000g有条件下离心120min，甲醇这两项时不应该用作制动合力。甲醇暂时后倾倒并弃除离心管之前的上清试管，至无上清试管的水。

中有：若搭配250mL离心管，在备有105mL污染物检验或先于离心后上清试管的250mL离心管之前加载时，染剂和钾添加剂应该等比例增加，其他加载相近。

7.1.4.3.可溶性一定量量化

7.1.4.3.1.在4℃、12000g有条件下将第二次离心后剩下的检验先次离心5min，甲醇这两项时不应该用作制动合力。甲醇暂时后用移试管器从离心管之前吸出并弃除剩下的上清试管。

7.1.4.3.2.转化成0.4mL无大分子酶井水转到到其之前的一个离心管之前，反复吹吸凝固，零点离心，使所有固棒状聚集在管底，将混悬试管吸出并转到到第二个离心管之前。

7.1.4.3.3.段落吹吸凝固和零点离心的加载后，先次将混悬试管吸出并转到到第三个离心管之前。

7.1.4.3.4.继续段落吹吸凝固和零点离心的加载，最终转变成的混悬试管即为该排泄物的一定量量化试管，棒状积约为0.6mL。将一定量量化试管移到至1.5mL离心管之前，于0℃～4℃有条件下留有，并于24h内没完成大分子所含和可视发射光谱RT-PCR检验。

中有：若搭配250mL离心管，按照7.1.4.3.1有条件先次离心并弃除剩下的上清试管后，在离心管之前转到0.4mL无大分子酶井水，反复吹吸凝固，并零点离心后即受益一定量量化试管。

7.2.镍海盐混凝凝固法则

7.2.1.法则则

向污染物之前转到镍海盐混凝剂，镍海盐井降解造成了的氢氧化镍胶棒状可吸附和包裹大肠杆菌薄膜，通过离心作用抽所取含大肠杆菌的胶棒状，然后通过化学蒸发释放出包裹的大肠杆菌薄膜，用以在此之后大分子所含和可视发射光谱RT-PCR检验。

7.2.2.醛和胶合板

7.2.2.1.醛

7.2.2.1.1.实验者用井水：GB/T6682规章的一级井水。

7.2.2.1.2.氯化镍氢氧化钾[c（AlCl3）=0.3mol/L]：称所取4g无井水氯化镍（纯度≥99%），摆在烧足球赛之前，转到100mL井水，冷却蒸发后移到至醛瓶之前。

7.2.2.1.3.硫酸氢氧化钾[c（NaOH）=1mol/L]：称所取4g硫酸（纯度≥96%），摆在烧足球赛之前，转到100mL井水，冷却蒸发后移到至醛瓶之前。

7.2.2.1.4.氯氢氧化钾[c（HCl）=1mol/L]：移所取43mL氯（量化纯，ρ20=1.19g/mL）于烧足球赛之前，转到适量井水，用玻璃棒冷却混匀后移到至500mL容量瓶之前，并定容至刻度。

7.2.2.1.5.乙二胺四乙酸二钠二井水合（C10H14N2O8Na2•2H2O）：纯度≥98%。

7.2.2.2.胶合板

7.2.2.2.1.冷藏螺口锥菱形瓶：100mL。

7.2.2.2.2.冷藏背著盖离心管：10mL、50mL。

7.2.2.2.3.冷藏移试管器吸头：200μL、1mL，背著滤芯，无大分子酶。

7.2.2.2.4.冷藏移试管管：50mL。

7.2.3.器材电源

7.2.3.1.冷藏甲醇：4℃，50mL飞轮，可背负重合力≥2500g。

7.2.3.2.保温涨落培养箱。

7.2.3.3.电子天平：分辨合力不低于0.001g。

7.2.3.4.pH计：精度≥0.01。

7.2.3.5.井水浴锅。

7.2.3.6.微生物安全和柜：II级或II级以上。

7.2.3.7.高热灭菌器。

7.2.3.8.移试管器：200μL、1mL。

7.2.3.9.高效率电动移试管器。

7.2.4.可溶性一定量量化流程

7.2.4.1.先于离心

所取少于50mL的污染物检验在4℃、2500g有条件下离心30min，留所取上清试管机内。剩下污染物检验作为硬盘。

中有：当污染物检验悬浮物浓度过高，可能直接影响大肠杆菌大分子所含和可视发射光谱RT-PCR检验时，应该改用先于离心弃除悬浮物后先顺利没完成在此之后加载。

7.2.4.2.可溶性一定量量化

7.2.4.2.1.絮凝处置

用高效率电动移试管器将50mL污染物检验或先于离心后的上清试管移到至100mL螺口锥菱形瓶之前，转到0.5mL0.3mol/L的氯化镍氢氧化钾，用1mol/L硫酸氢氧化钾或1mol/L氯氢氧化钾通气排泄物pH=6.0±0.1。将螺口锥菱形瓶盖拧紧，摆在保温涨落培养箱之前，以150r/min的速率在固棒状下混杂15min。

7.2.4.2.2.离心分离

将排泄物移到至50mL离心管之前，在4℃、1900g有条件下离心5min。

7.2.4.2.3.甲酸蒸发

倾倒弃除离心管之前的上清试管，在剩下胶棒状之前转到0.20g±0.01g乙二胺四乙酸二钠二井水合，摇晃数十次至胶棒状转化成试管态，移到至10mL离心管之前。将10mL离心管摆在井水浴锅之前，60℃井水浴10min。井水浴后离心管之前的固棒状即为该排泄物的一定量量化试管，棒状积约为1mL，于0℃～4℃有条件下留有，并于24h内没完成大分子所含和可视发射光谱RT-PCR检验。

7.3.离心可数法则

7.3.1.法则则

搭配嵌于有可数膜的可数足球赛，通过离心作用将小分子少于可数膜囤积小分子的大肠杆菌薄膜囤积在可数足球赛内，抽所取可数足球赛之前的大肠杆菌一定量量化试管，用以在此之后大分子所含和可视发射光谱RT-PCR检验。

7.3.2.胶合板

7.3.2.1.一次性可数足球赛：囤积小分子为30kDa，棒状积为70mL，可翻转离心丢弃检验。

7.3.2.2.冷藏背著盖离心管：2mL，无大分子酶；50mL。

7.3.2.3.冷藏移试管器吸头：1mL，背著滤芯，无大分子酶。

7.3.2.4.冷藏移试管管：50mL。

7.3.3.器材和电源

7.3.3.1.冷藏甲醇：4℃，50mL飞轮，可背负重合力≥6000g。

7.3.3.2.冷藏甲醇：4℃，250mL井高水平飞轮，可背负重合力≥3000g。

7.3.3.3.微生物安全和柜：II级或II级以上。

7.3.3.4.高热灭菌器。

7.3.3.5.移试管器：1mL。

7.3.3.6.高效率电动移试管器。

7.3.4.可溶性一定量量化流程

7.3.4.1.先于离心

7.3.4.1.1.用高效率电动移试管器移所取50mL污染物检验于50mL离心管之前，在4℃、5000g有条件下离心30min，分别延续上清试管和凝固物。剩下污染物检验作为硬盘。

7.3.4.1.2.所取0.5mL上清试管转到到延续凝固物的离心管之前，将凝固物重悬混匀，延续待用。

7.3.4.2.可溶性一定量量化

7.3.4.2.1.可数足球赛前处置：所取30mL冷藏井水转到到容器一定量量化足球赛之前，用作井高水平飞轮在4℃、2480g有条件下离心10min，弃除滤试管抽所取足球赛之前的滤出试管，先将容器一定量量化足球赛反向翻转在一定量量化试管抽所取足球赛上，在4℃、920g有条件下离心3min，弃除抽所取试管。

7.3.4.2.2.将7.3.4.1.1先于离心受益的上清试管移到至容器一定量量化足球赛之前，用作井高水平飞轮在4℃、2480g有条件下离心15min。如容器一定量量化足球赛之前残留固棒状棒状积较多，可适当延长离心整整，此后一定量量化足球赛之前固棒状约为0.3mL～0.6mL。

7.3.4.2.3.待全部上清试管一定量量化没完成后，将容器一定量量化足球赛反向翻转在一定量量化试管抽所取足球赛上，在4℃、920g有条件下离心3min，转化成一定量量化试管抽所取足球赛之前的固棒状，移到至2mL离心管之前。

7.3.4.2.4.转化成7.3.4.1.2先于离心受益的凝固物混悬试管0.5mL，与7.3.4.2.3之前受益的固棒状混杂，即为该排泄物的一定量量化试管，棒状积约为0.8mL～1.1mL，于0℃～4℃有条件下留有，并于24h内没完成大分子所含和可视发射光谱RT-PCR检验。

中有1：也可搭配囤积小分子为100kDa的可数足球赛，但近似于该离心一定量量化时重合力不宜多达3000g；

中有2：也可搭配不背著翻转离心基本功能的可数足球赛，但在没完成7.3.4.2.2后，7.3.4.2.3应该更名“待全部上清试管一定量量化没完成后，所取下容器一定量量化足球赛，用移试管器转化成一定量量化固棒状小心吹打膜数次后，转化成所有一定量量化试管并移到至2mL离心管之前”。

8.大分子检验

8.1.大分子所含

8.1.1.醛和胶合板

8.1.1.1.醛

8.1.1.1.1.大肠杆菌大分子所含醛盒。

8.1.1.1.2.无大分子酶井水：微生物技术级。

8.1.1.2.胶合板

8.1.1.2.1.冷藏背著盖离心管：1.5mL，无大分子酶。

8.1.1.2.2.冷藏移试管器吸头：10μL、200μL、1mL，背著滤芯，无大分子酶。

中有：其他胶合板参见所用大肠杆菌大分子所含醛盒。

8.1.2.器材和电源

8.1.2.1.微生物安全和柜：II级或II级以上。

8.1.2.2.高热灭菌器。

8.1.2.3.移试管器：10μL、200μL、1mL。

中有：其他器材和电源参见所用大肠杆菌大分子所含醛盒。

8.1.3.大分子所含流程

在微生物安全和柜之前推开备有污染物检验一定量量化试管的离心管，按照大肠杆菌大分子所含醛盒说明，所取适量一定量量化试管顺利没完成大分子所含，所含没完成后应该立即封盖并正要顺利没完成可视发射光谱RT-PCR检验。剩下的一定量量化试管和大分子检验应该于-80℃有条件下冻存。

8.2.可视发射光谱RT-PCR检验

8.2.1.醛和胶合板

8.2.1.1.醛

8.2.1.1.1.新型病原大分子检验醛盒（发射光谱PCR法则）。

8.2.1.1.2.无大分子酶井水：微生物技术级。

8.2.1.2.胶合板

8.2.1.2.1.冷藏移试管器吸头：10μL、100μL、200μL、1mL，背著滤芯，无大分子酶。

8.2.1.2.2.冷藏PCR管或PCR板：无大分子酶。

8.2.2.器材和电源

8.2.2.1.可视发射光谱PCR仪。

8.2.2.2.混匀器。

8.2.2.3.微生物安全和柜：II级或II级以上。

8.2.2.4.移试管器：10μL、100μL、200μL、1mL。

中有：其他器材和电源参见所用新型病原大分子检验醛盒。

8.2.3.检验流程

8.2.3.1.检验抗大肠杆菌同样原则

改用双抗大肠杆菌检验，针对停止使用读码框内1ab（openreadingframe1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsidprotein，N）。必要时可根据检验供给和无关规章顺利没完成删减。

8.2.3.2.化学反应该基本概念

参见新型病原大分子检验醛盒参考资料。每个检验设置3个直线。

9.运动速度操纵

9.1.可溶性一定量量化运动速度操纵

9.1.1.可溶性一定量量化特征性运动速度操纵

9.1.1.1.将通过观察到的污染物检验灭活后，转到污染物之前不存在的非人源大肠杆菌（如：鼠肝炎大肠杆菌、山羊病原、山羊呼吸道合胞大肠杆菌、新型病原假大肠杆菌等特征性质控），加标浓度为1000copies/mL，作为可溶性一定量量化特征性质控的集。可溶性一定量量化特征性质控的集检验每一次与污染物检验检验每一次完全相近，但可视发射光谱RT-PCR时应该用作相应该大分子检验醛盒。

9.1.1.2.在每一同型检验之前应该有数继续做一个可溶性一定量量化特征性质控的集。

9.1.2.可溶性一定量量化有性运动速度操纵

9.1.2.1.检验通过观察时用无大分子酶井水正因如此污染物检验，将其作为可溶性一定量量化有性质控的集。可溶性一定量量化有性质控的集检验每一次与污染物检验检验每一次完全相近。

中有：可溶性一定量量化有性质控的集同时也是谐波每一次空白对照的集。

9.1.2.2.在每一同型检验之前应该有数继续做一个可溶性一定量量化有性质控的集。

9.2.大分子所含运动速度操纵

9.2.1.大分子所含特征性运动速度操纵

9.2.1.1.用作9.1.1.1之前特征性质控作为大分子所含每一次特征性质控的集。大分子所含特征性质控的集检验每一次与污染物检验从大分子所含开始的检验每一次完全相近，但可视发射光谱RT-PCR时应该用作相应该大分子检验醛盒。

9.2.1.2.在每一同型大分子所含每一次之前应该有数继续做一个大分子所含特征性质控的集。

9.2.2.大分子所含有性运动速度操纵

9.2.2.1.用作无大分子酶井水作为大分子所含每一次有性质控的集。大分子所含有性质控的集检验每一次与污染物检验从大分子所含开始的检验每一次完全相近。

9.2.2.2.在每一同型大分子所含每一次之前应该有数继续做一个大分子所含有性质控的集。

9.3.PCR检验运动速度操纵

9.3.1.PCR检验特征性运动速度操纵

9.3.1.1.用作新型病原大分子检验醛盒之前的特征性质控作为PCR检验每一次特征性质控的集。化学合成化学反应该基本概念时用PCR特征性质控的集正因如此检验大分子转到，其他加载与污染物检验PCR检验每一次完全相近。

9.3.1.2.在每一同型可视发射光谱RT-PCR每一次之前应该有数继续做一个PCR检验特征性质控的集。

9.3.2.PCR检验有性运动速度操纵

9.3.2.1.用作新型病原大分子检验醛盒之前的有性质控作为PCR检验每一次有性质控的集。化学合成化学反应该基本概念时用PCR有性质控的集正因如此检验大分子转到，其他加载与污染物检验PCR检验每一次完全相近。

9.3.2.2.在每一同型可视发射光谱RT-PCR每一次之前应该有数继续做一个PCR检验有性质控的集。

10.结果与报告

10.1实验者持续性推断

实验者结果应该满足此表1要求，否则实验者视为在先。

此表1.实验者持续性推断常规

10.2.结果断定

10.2.1.PCR结果推断

10.2.1.1.有性：无Ct绝对值、无S菱形为了将曲线。

10.2.1.2.特征性：Ct绝对值大于或大于新型病原大分子检验醛盒参考资料规章绝对值，且有S菱形为了将曲线。

中有：或以其产品参考资料基准。

10.2.2.特征性检验推断

10.2.2.1.双抗大肠杆菌：同一份检验之前新型病原2个抗大肠杆菌（ORF1ab和N）可视发射光谱RT-PCR之外出现特征性检验结果，即2个抗大肠杆菌的3个直线的集各出现有数1个特征性检验结果，检验断定为特征性，例如：ORFlab+/-/-，N-/+/-。

10.2.2.2.单抗大肠杆菌：同一份检验之前新型病原单抗大肠杆菌（ORFlab或N）可视发射光谱RT-PCR有数2个直线的集出现特征性检验结果，检验断定为特征性，例如：ORFlab+/+/-，N-/-/-或ORFlab-/-/-，N+/+/-。当出现单个抗大肠杆菌只有1个直线的集为特征性检验结果时，需对该检验再度顺利没完成可溶性一定量量化和大分子所含，并顺利没完成可视发射光谱RT-PCR检验，若仍出现特征性检验结果，则检验断定为特征性。

10.3.结果报告

根据检验结果，报告“检出新型病原大分子”或“没检出新型病原大分子”。

11.Laboratory安全和

11.1.微生物安全和

污染物检验通过观察时与生俱来防护要求应该符合WS/T697无关规章。检验灭活、检验等加载应该在微生物安全和二级及以上Laboratory顺利没完成，同时改用不低于微生物安全和三级Laboratory的与生俱来防护。排泄物通过观察后，可溶性一定量量化、大分子所含和可视发射光谱RT-PCR检验等所有加载之外应该避免检验渗送入于外环境。实验者每一次之前造成了的所有废物（最主要剩下排泄物）之外应该经有效灭菌后先按医疗废物顺利没完成归纳处置。

11.2.Laboratory设机内作安全和

甲醇应该备有不适度震荡推测及报警装置。

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